PCR反應開始前的準備工作
日期：2025-05-13 06:09
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摘要：
PCR反應開始前，你需要準備好DNA模板（基因組DNA或者反轉錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動設計或利用軟件設計）并選擇合適的商業化DNA聚合酶（根據實驗的目的不同做出決定）。
1. DNA聚合酶的選擇。市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇適合自己實驗需要的產品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到沒有任何突變的PCR產物，那應當選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Taq聚合酶已經足夠。另外要注意...
PCR反應開始前，你需要準備好DNA模板（基因組DNA或者反轉錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動設計或利用軟件設計）并選擇合適的商業化DNA聚合酶（根據實驗的目的不同做出決定）。
1. DNA聚合酶的選擇。市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇適合自己實驗需要的產品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到沒有任何突變的PCR產物，那應當選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Taq聚合酶已經足夠。另外要注意的一點是，進行T載體連接的時候，要了解高保真的聚合酶所得的產物是沒有A末端的，因此你在T載體連接之前需要進行加A反應。或者直接選用普通的Taq聚合酶。
2. 引物。引物特異性會影響到PCR反應成功的可能性，好的引物設計對PCR成功至關重要。設計引物時，有以下幾條原則需要謹慎考慮：
1. 引物長度。通常PCR引物長度在18-22個堿基之間。這對引物的特異性以及退火溫度而言均已足夠。
2. 解鏈溫度Tm。Tm值的定義是使得一半雙鏈DNA解螺旋成為單鏈DNA的溫度。引物的Tm值通常要在52-58度之間。
3. GC含量。適合的GC含量為40-60%。
就目前而言很多軟件都可以用來設計引物，如primer5和Oligo。通常這些軟件設計得到的引物均可以滿足需要。